竹叶青蛇咬伤广西巴马小香猪动物模型的构建与

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摘要：0 引言 Introduction 毒蛇咬伤是被世界卫生组织列为一个易忽视的重要的热带/亚热带疾病之一，全球每年约有500万蛇伤事件发生，造成约2.5万至12.5万人死亡[1-2]。而在全球范围内，毒蛇咬

0 引言 Introduction

毒蛇咬伤是被世界卫生组织列为一个易忽视的重要的热带/亚热带疾病之一，全球每年约有500万蛇伤事件发生，造成约2.5万至12.5万人死亡[1-2]。而在全球范围内，毒蛇咬伤的高发区为东亚、东南亚以及撒哈拉沙漠以南的非洲地区[3]。其中，竹叶青蛇(Trimeresurus stejnegeri，TS)是东南亚毒蛇咬伤的主要致伤蛇之一[4]。竹叶青属蝰科蝮亚科，毒牙属管牙类[5-7]，研究表明其分泌毒液主要是以血循毒为主的混合毒液[7-9]。竹叶青蛇咬伤中毒临床表现多样，病情变化迅速，如果治疗不及时，患者可能发生多器官功能衰竭和后遗症，严重者会导致患者死亡[10]。近年来随着城镇化的快速发展，城市建筑以及相应绿化带面积不断扩建，竹叶青蛇咬伤人数越来越多，给临床患者的诊治带来了极大地挑战[11]。遗憾的是，目前尚未有关于竹叶青蛇咬伤猪模型的研究[12]，并且猪拥有与人类非常相似的基因特征，组织器官及生化指标也与人类相似[13]。因此建立一种能够反映竹叶青蛇咬伤病理生理过程，并具有较好的操作性及重复性的动物模型对竹叶青蛇咬伤的研究具有积极意义[14-15]。

此次研究尝试以广西巴马小香猪为实验动物，肌肉注射竹叶青蛇毒的方式建立竹叶青蛇伤模型[16]，通过观察注射蛇毒前后行为学变化、血液学指标改变[17]、病理学分析等方面进行评价，从而为后续研究提供基础[18]。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年10月至2020年1月在广西医科大学生命科学研究院及广西医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及饲料 KM小鼠50只，雌雄各半，18-22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK (桂)2014-0003。广西巴马小香猪12只，体质量10 kg左右，购买于广西大学动物科学院，许可证号：SCXK桂2018-0003。动物实验经过学校动物伦理学委员会审查和批准。所有动物饲养于广西医科大学实验动物中心，猪饲料由巴马原种香猪农牧实业有限公司提供，喂养前用水泡至糊状方可喂养，小鼠饲料由广西医科大学实验动物中心提供，动物饮水来自实验室常规自来水。适应性喂养1周后，按实验需要进行分组。

1.3.2 主要试剂与仪器 BC-6800PLUS全自动血液细胞分析仪、Bs-2000全自动化学分析仪(深圳迈瑞科技股份有限公司)；CS-5100全自动凝血分析仪(希森美康生物科技有限公司)；YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)；MicroCL17R型高速低温离心机(德国THERMOIEC公司)；枸橼酸钠凝血试验管、乙二胺四乙酸抗凝管(美国BD公司)；竹叶青蛇毒冻干粉(黄山蕲蛇科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 竹叶青蛇毒对小鼠半数致死量(LD50)的测定 选取KM小鼠50只，随机分为5组，每组10只，以文献报道KM小鼠肌肉注射的100%致死量和0%致死量为依据[19-20]，按0.75组间距设置17.47，14.85，12.62，10.73，9.12 mg/kg 5个剂量组，10 μL/g肌肉注射，连续观察并记录7 d小鼠的死亡情况，直至小鼠不再因为竹叶青蛇毒作用而死亡。采用Bliss法(版)probit模型计算竹叶青蛇毒对小鼠的LD50[21-23]。

1.4.2 模型制备 选取健康巴马小香猪12只，随机分为模型组6只和对照组6只，以竹叶青蛇毒对小鼠肌肉注射的LD50剂量为依据，通过等效剂量系数折算法和体表面积法进行换算[24-26]，得出竹叶青蛇蛇毒对巴马小香猪的理论半数致死量。参照毒理学常规造模方法[27]，半数致死量的1/15-1/2进行造模[28]，且经过前期高、中、低剂量的预实验，最终采用理论半数致死量的1/3即0.643 mg/kg作为造模注射浓度，实验表明这个浓度不仅能使小猪出现明显中毒现象，且保证实验动物在实验期间没有死亡。因此，采用理论半数致死量的1/3作为模型组的注射浓度[29]，按照猪质量0.2 mL/kg剂量，于小猪左腿外侧肌肉注射竹叶青蛇毒；对照组按照小猪体质量0.2 mL/kg在猪左腿外侧处肌肉注射生理盐水。

实验动物造模过程的相关问题造模目的： 构建并评价竹叶青蛇咬伤广西巴马小香猪的动物模型借鉴已有标准实施动物造模：参照毒理学常规造模方法[27]，建立竹叶青蛇伤动物模型动物来源及品系： KM小鼠由广西医科大学实验动物中心提供；广西巴马小香猪购买于广西大学动物科学院模型与所研究疾病的关系：为竹叶青蛇咬伤的病理机制及诊治提供理想动物模型造模技术描述： 采用一次性肌肉注射竹叶青蛇毒的方式建立竹叶青蛇伤模型，以理论半数致死量的1/3即0.643 mg/kg作为模型组的注射浓度[29]，按照0.2 mL/kg剂量，于小猪左腿外侧肌肉注射竹叶青蛇毒造模主要诱导用药：竹叶青蛇毒动物数量及分组方法：选取健康巴马小香猪12只，随机分为模型组6只和对照组6只造模成功评价指标：以中毒猪的生物学行为作为评价模型成功与否的主要指标造模后实验观察指标：①竹叶青蛇毒的小鼠LD50；②竹叶青蛇毒中毒猪生物学行为变化；③血液学指标检测结果；④竹叶青蛇毒中毒猪组织病理分析造模后动物处理： 在注射竹叶青蛇蛇毒后6 h和24 h，于小猪前腔静脉丛分别采集猪的血液，进行血液学指标检测；末次采血1 h后，麻醉小猪，分别取出小猪的心脏组织、脑组织、肺组织、肝组织、肾组织和注射部位肌肉组织，进行相关指标检测伦理委员会批准： 实验方案经广西医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号为)

文章来源：《考试与评价》 网址: http://www.ksypjzz.cn/qikandaodu/2021/0119/1053.html

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